Materiales y Métodos
Enfermedades
al microscopio
Materiales y Métodos Enfermedades
al microscopio |
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Como ya
hemos indicado en anteriores ocasiones, uno de nuestros objetivos es poner a
disposición del profesorado técnicas que puedan realizarse con
materiales caseros. Aunque en las páginas anteriores se muestran algunos
detalles hemos creído conveniente crear una página en la que se
detallen todos los aspectos necesarios para su realización. A continuación
mostraremos imágenes y explicaciones de las mismas junto con un enlace a un documento PDF
que recoge, a modo de cuaderno de laboratorio, todas las técnicas y experiencias
realizadas. Incluye un enlace a otro documento anterior más completo
respecto a los proyectos anteriores.
Todos los materiales han sido adquiridos en comercios
de la localidad, salvo el formol que lo compramos en Amazon.
A continuación tenemos los enlaces a los apartados correspondientes a las técnicas utilizadas, junto con el correspondiente a <Ampliar información>, desde el que podrá acceder a artículos relacionados con el tema.
El cultivo en cámara húmeda es un método ideal para estudiar los hongos. Solo consiste en colocar un papel de filtro en la base de una placa de Petri y colocar sobre el papel los materiales que queramos estudiar. Si mantenemos húmedo el papel conseguiremos que las esporas presentes germinen y nos permitan ver las hifas y otras estructuiras presentes en los hongos. Si antes de introducir el material, en este caso las hojas, queremos eliminar los organismos que estén sobre ellas podemos sumergir unos momentos las hojas en lejía comercial al 20%
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Si no tenemos papel de filtro ni placas de Petri podemos utilizar papel de cocina y cualquier recipiente adecuado. En cualquier caso, si queremos cultivar una especie concreta deberemos asegurarnos de que el material empleado sea esteril. Como es posible que el material empleado no soporte altas temperaturas para la esterilización, ésta puede hacerse de una forma aceptablemente eficaz utilizando lejía comercial y enjuagando posteriormente con agua hervida. En el caso del papel de filtro puede meterse en un horno a una temperatura no demasiuado alta, para que no se provoque la ignición. |
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Si queremos cultivar muchas muestras o de tamaño que no quepan en una placa de Petri, o recipiente equivalente podemos utilizar una bandeja del tamaño deseado, en la que colocaremos una rejilla con patas para separarla del fondo y un papel que cuelgue por los dos lados y que llegue hasta el fondo, que llenaremos de agua. En este caso utilicé una tarrina de helado y una rejilla de plástico a la que pegué unos tacos de plástico con pegamento de tipo "No más clavos". |
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Un
sistema alternativo al anterior, que puede ser útil, si simplemente
queremos ver hifas, consiste en envolver las hojas en papel de cocina
y meterlas en un frasco en el que añadiremos un poco de agua en
el fondo, para que el papel se mantenga húmedo. |
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Otra
posibilidad en la línea anterior y extremadamente fácil,
es cortar secciones de las zonas en las que pensemos que hay hongos, por
ejemplo manchas en hojas de olivo con repilo, y echarlas en un recipìente
con agua azucarada. Tras unos días sacamos los fragmentos de hojas
y veremos sus bordes llenos de hifas. |
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Para cultivar bacterias y hongos podemos hacerlo en placas de agar. En el caso de organismos fitopatógenos el medio tradicional es el PDA (Potato Dextrose Agar), es decir placa de agar fabricada con extracto de patata azucarado con dextrosa. En nuestro caso hemos utilizado agar comprado en un hipermercado y azucar (sacarosa) el lugar de dextrosa. Para la preparación procedimos de la siguiente forma:
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Para el cultivo de las bacterias productoras de la tuberculosis del olivo (Pseudomonas savastanoi) procedimos de la forma siguiente:
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En
esta imagen tenermos el resultado de este cultivo masivo. |
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| En el caso de los hongos raspamos varias hojas sobre la placa, con este resultado. |  |
| Siembra de Pseudomonas en estrias |  |
| Para el montaje de las preparaciones hemos utilizado varios procedimientos: | |
Extracción con cinta adhesiva y pegado de ésta sobre un porta. Hemos utilizado este procedimiento tanto para los cultivos en cámara humeda como para cultivos en placa.
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En
el caso de las muestras de tuberculosis pusimos una gota del extracto
y sobre ella un cubre, para las muestras "in vivo"
(como la de la imagen), y realizamos un frotis para las muestras fijadas,
que posteriormente fueron teñidas con la técnica de Gram,
que veremos en el apartado siguiente. |
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Algunas
muestras, obtenidas de colonias de hongos, se colocaron con un asa de
siembra sobre una gota de colorante (Lactoglicerol fucsina), se cubrieron
con un cubre y se selló éste al porta con laca de uñas,
para conseguir una preparación estable por tiempo indefinido. |
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Las
preparaciones obtenidas por el sistema de fijación/inclusión
en resina se explicaran en el apartado correspondiente. |
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Hemos
realizado tres modos diferentes de tinción: el explicado anteriormente
con Lactoglicerol fucsina, el azul de toluidina para las secciones incluidas
que veremos en el proximo apartado y la tinción de Gram para bacterias
que explicaremos a continuación.
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La técnica de Gram es el sistema de tinción más utilizado en microbiología, ya que permite una primera clasificación en bacterias Gram+ y Gram-. Se realiza en los siguientes pasos:
Los tiempos indicados son relativos, debiéndose adaptar cada vez que se haga el colorante. |
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Las
bacterias Gram+ poseen, sobre la membrana plasmática,
una capa gruesa de mureina (peptidoglicano) que retiene el complejo cristal
violeta-lugol, tiñéndose de color morado o azul intenso. En las Gram-, esta capa es mucho más delgada, poseyendo además una membrana externa. Esta estructura no retiene el cristal violeta, por lo que al decolorarlas con alcohol-acetona se vuelven transparentes, debiendo teñirse de nuevo con safranina, que les da un color rosa o rojo. |
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| En estas imágenes puede verse el resultado de la tinción, observándose la diferencia entre las Gram+ y las Gram-. |  |
Fijación/inclusión en resina de poliéster.
Para poder cortar, o en nuestro caso reducir el
grosor mediante el lijado, es necesario que el material biológico esté
embebido en un medio de cierta dureza, como es la parafina o en nuestro caso
la resina de poliéster. Para ello son necesarios los siguientes pasos:
Obtención de preparaciones.
En
esta fotografía podemos ver la imagen de una sección de
una hoja de olivo obtenida por el procedimiento descrito y teñida
con azul de toluidina correspondiente al proyecto presentado en 2023,
y en la página de imágenes algunas
correspondientes al presente proyecto. |
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En la página https://www.olivaryescuela.es/divulgacion/Rincon/rincon_2023/MaterMetod5.htm puede ver muchos más detalles sobre el proceso.