| Cultivo y
observación de pseudomonas. |
| Esterilización de las placas de Petri
y los tubos de ensayo.
Primero hemos lavado todos los materiales, secado e introducido
en una olla a presión con agua, durante unos 15 minutos.
Tras ello, sacamos los materiales de la olla y los dejamos
enfriar para envolverlos posteriormente con papel de aluminio.
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| Materiales y pasos seguidos para la preparación
del medio de cultivo con Bovril.
Para la preparación de este medio de cultivo hemos
utilizado Bovril, que es un concentrado de carne de buey.
Hemos cogido una cucharada pequeña de Bovril y
la hemos mezclado con 0,5 L de agua.
Después le hemos añadido dos cucharadas
pequeñas de glucosa e introducido posteriormente en una olla durante
15 minutos al baño María.
Para preparar el medio sólido de Bovril le añadimos
a la preparación anterior agar al 3%, y lo mezclamos bien calentando
la mezcla. |
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| Materiales y pasos seguidos para la preparación
del medio de cultivo con aceitunas.
Para preparar este medio de cultivo hemos utilizado 45
aceitunas que habían estado anteriormente en salmuera.
Primero las hemos deshuesado, machacado en un mortero
con un poco de agua y triturado con una batidora.
Después le añadimos 2 cucharadas grandes
de glucosa y tras ello filtramos la mezcla: primero con un colador y posteriormente
con un embudo y papel de filtro de café.
Finalmente esterilizamos el medio al igual que el medio
de Bovril.
Para el medio sólido le añadimos agar al
3% y lo mezclamos bien caléntandolo. |
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| Para obtener las Pseudomonas savastanoi recogimos
del campo varias ramas infectadas por esta enfermedad.
Cogimos los nódulos y los machacamos en un mortero
con un poco de agua.
Posteriormente lo vertimos en dos tubos de ensayo y los
centrifugamos en la centrifugadora. |
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| Después cogimos una muestra para observarla
en el microscopio, y ver si había pseudomonas.
Observamos que si había, y también observamos la presencia
de otras bacterias.
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| Por ellos, realizamos una siembra en una placa
de agar sangre, limpiando previamente la zona de trabajo con alcohol y encendiendo
un mechero Bunsen para crear una corriente que evite la posible contaminación. |
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| Una vez que creció la siembra, observamos diferentes
colonias, por lo que cogimos una muestra de cada una de ellas y las sembramos
en diferentes placas de Petri y tubos de ensayo. |
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| Cuando crecieron todas las siembras observamos al microscopio
una muestra de cada una de ellas para saber cuales eran pseudomonas. |
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| Preparación de los reactivos para la Tinción
de Gram:
Preparación de la disolución de Violeta
de Genciana:
Realizamos una disolución al 1% de Violeta de Genciana
vertiéndola en un vaso de precipitado y calentamos la disolución
para facilitarla. |
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| Preparación de la disolución de Lugol:
Hemos disuelto Yodo al 1% en Yoduro Potásico al 2%.
Tras ellos calentamos la disolución al igual que la anterior.
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| Preparación de la Fucsina Básica:
Realizamos la disolución al 1% de Fucsina Básica y, posteriormente,
la calentamos al igual que las dos anteriores
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TÉCNICA 1 PARA LA TINCIÓN DE GRAM:
- Depositamos una gota de agua destilada sobre un porta
y posteriormente suspendimos y extendimos las bacterias procedente de
la colonia aislada en una placa de Petri con ayuda de una asa de siembra.
- Fijamos el material con calor, utilizando un mechero
Bunsen.
- Cubrimos el material con Violeta de Genciana durante
1 minuto.
- Enjuagamos con agua destilada.
- Cubrimos el material con Lugol durante 1 minuto.
- Enjuagamos con alcohol.
- Cubrimos el material con Fuscina Básica durante
1 minuto.
- Enjuagamos con agua destilada.
- Dejamos secar al aire la preparación.
- Observamos con aceite de inmersión bajo un
microscopio óptico con el objetivo de 100x, considerando Gram
negativas las bacterias ya que quedaron teñidas de un color rosa
rojizo.
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| Como no quedamos satisfechas con el resultado obtenido,
decidimos realizar otra técnica algo variada de la Tinción
de Gram. |
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TÉCNICA 2 PARA LA TINCIÓN DE
GRAM:
- Depositaremos una gota de agua destilada sobre un
porta y posteriormente suspenderemos y extenderemos las bacterias procedente
de la colonia aislada en una placa de Petri con ayuda de una asa de
siembra.
- Fijaremos el material dejándolo secar a temperatura
ambiente.
- Cubriremos el material con Violeta de Genciana durante
1-2 minutos.
- Tiraremos el exceso de Violeta de Genciana y cubriremos
el material con Lugol durante 1-2 minutos.
- Tiraremos el exceso de Lugol y cubriremos el material
con Fuscina Básica durante 1-2 minutos.
- Enjuagaremos el porta con agua destilada y dejaremos
secar al aire.
- Observaremos con aceite de inmersión bajo un
microscopio óptico con el objetivo de 100x.
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| Comprobación del resultado obtenido para la tinción
de Gram:
Realizaremos la confirmación del resultado obtenido en la tinción
a través del test del KOH (Gregersen, 1978).
Para ello tomaremos una muestra de bacterias procedentes de la misma
colonia utilizada para la tinción, y las depositaremos sobre una
gota de KOH al 3% extendiéndolas y mezclándolas con la gota.
El test considerara que la bacteria es Gram negativa si la suspensión
celular obtenida adopta un aspecto viscoso.
Ello nos confirmó la correcta realización de la Tinción
de Gram.
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| Tras el primer paso de la tinción de Gram (I).
(Violeta de Genciana).
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| Tras el primer paso de la tinción de Gram (II).
(Violeta de Genciana).
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| Aspecto final tras la tinción de Gram (I). |
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| Aspecto final tras la tinción de Gram (II). |
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| Otras experiencias. |
| Experiencias con otros medios |
Además de los ingredientes anteriores, añadiéndoles
ácido bórico y borax (para evitar el crecimiento de hongos)
y triptófano (para un mejor crecimiento de las pseudomonas), y otros
con antibiótico (se supone que en los medios con antibiótico,
nuestras psdudomonas no deberían crecer). |
Inoculación de las plantas con Pseudomonas
savastanoi.
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Hemos realizado dos experimentos con las plantas de soja verde:
-El primero consiste en 4 tubos de ensayo con agua, 2 de ellos infectados
con las bacterias, y otros 2 sin contaminar.
-El segundo consiste en 8 tubos de ensayo con medio de bovril, 4 de ellos
infectados por las bacterias y otros 4 sin infectar.
El lunes realizaremos algún otro experimento, si es tarde para llevarlo
a la feria, lo realizaremos solo para nuestro trabajo de investigación. |
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